Les colonnes d'HPLC
La colonne un élément majeur de la chaîne d'HPLC qui permet une plus ou moins bonne séparation des solutés.
Constitution et phase stationnaire
Elles se présentent sous la forme d'un tube d'une dizaine de cm en acier d'un diamètre de 2 à 5 mm. Cependant des colonnes capillaires sont de plus en plus utilisées (ID = 1 mm).
Une colonne de garde est généralement placée avant la colonne ce qui permet de la préserver d'éventuels polluants qui resteraient en tête de colonne.
Un filtre est également installé en sortie de pompe pour éliminer toutes les particules solides qui pourraient obstruer la colonne.
La phase stationnaire: elle est le plus souvent en gel de silice [SiO2-x/2(OH)x]n(H2O)p qui est par la suite greffée pour améliorer les propriétés.
Elles sont fabriquées par synthèse sol-gel.
Plus la taille des particules est petite, meilleure sera la résolution. En contre-partie la perte de charge augmente et donc la pression également. Ces recherches de performance
ont amené les fabricants à développer la chromatographie liquide ultra haute pression (UHPLC). A noter que les colonnes Core-Shell permettent d'avoir une excellente résolution avec une HPLC classique (moins de 400 bars).
La plupart des colonnes actuelles utilisées en HPLC sont peu polaires et hydrophobes. Elles sont dîtes à phase inverse.
Parmi elles, les colonnes de type C18 sont les plus courantes. Le terme C18 correspond à un greffage d'une chaîne carbonnée de 18 carbones (CH2)17-CH3 sur le gel de silice.
Les phases stationnaires C8, un peu moins apolaires sont également très largement utilisées.
Toutefois, les colonnes fonctionnant en mode HILIC (Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography) permettent désormais de séparer des composés polaires.
Les colonnes sont classées selon l'hydrophobicité de la phase stationnaire. Malgré tout le choix d'une colonne pour une analyse donnée peut s'avérer compliqué étant donné le nombre de produits disponibles. Le plus simple est donc de demander directement conseil au fabricant.